Scholar Hub/Chủ đề/#protein tái tổ hợp/
Protein tái tổ hợp là một phần quan trọng của công nghệ sinh học hiện đại, được sản xuất từ việc chèn gen mã hóa vào hệ thống tế bào chủ để tạo ra protein với độ tinh khiết cao. Công nghệ này khởi đầu từ thập niên 1970, nổi bật với sản xuất insulin giúp nhiều bệnh nhân tiểu đường. Quá trình sản xuất gồm các bước: chọn lọc gen, chèn gen vào vector, chuyển vector vào tế bào chủ, sản xuất protein, và tinh chế. Ứng dụng rộng rãi trong y học, công nghiệp thực phẩm, và nghiên cứu. Dù có lợi ích lớn, công nghệ đối mặt với thách thức về chi phí và tiêu chuẩn chất lượng.
Giới thiệu về Protein Tái Tổ Hợp
Protein tái tổ hợp đã trở thành một phần quan trọng của công nghệ sinh học hiện đại. Chúng là những protein được tạo ra từ việc chèn gen mã hóa protein mong muốn vào một hệ thống tế bào chủ, sau đó các tế bào chủ này sẽ sản xuất ra protein tương ứng. Kỹ thuật này cho phép sản xuất số lượng lớn protein với độ tinh khiết và hiệu suất cao.
Lịch sử phát triển
Công nghệ sản xuất protein tái tổ hợp bắt đầu phát triển vào những năm 1970, với những tiến bộ trong lĩnh vực sinh học phân tử và kỹ thuật di truyền. Thành công đầu tiên có thể kể đến là sản xuất insulin tái tổ hợp, giúp cải thiện cuộc sống của hàng triệu người mắc bệnh tiểu đường.
Quá trình sản xuất protein tái tổ hợp
Quá trình sản xuất protein tái tổ hợp thường bao gồm các bước sau:
- Chọn lọc và cô lập gen: Xác định và tách rời gen mã hóa protein mong muốn từ nguồn tự nhiên.
- Chèn gen vào vector biểu hiện: Gen được chèn vào vector plasmid, có khả năng tự tái tạo và thể hiện trong tế bào chủ.
- Chuyển vector vào tế bào chủ: Vector được đưa vào các tế bào chủ, thường là vi khuẩn E. coli, nấm men hoặc tế bào động vật.
- Sản xuất protein: Tế bào chủ sản xuất protein theo hướng dẫn từ gen đã chèn.
- Thu hoạch và tinh chế protein: Protein được chiết tách và tinh chế để sử dụng trong nghiên cứu hoặc ứng dụng y tế.
Ứng dụng của protein tái tổ hợp
Protein tái tổ hợp được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như:
- Y học: Sử dụng để sản xuất các hormone, kháng thể, và enzyme điều trị.
- Công nghiệp thực phẩm: Ứng dụng trong sản xuất enzyme tăng cường hiệu quả của quá trình lên men.
- Nghiên cứu khoa học: Cung cấp protein để nghiên cứu cấu trúc và chức năng trong sinh học phân tử.
Lợi ích và hạn chế
Lợi ích: Công nghệ protein tái tổ hợp cho phép sản xuất protein với độ tinh khiết cao và số lượng lớn. Nó cũng linh hoạt trong việc sản xuất các protein dễ bị phân hủy hoặc khó tổng hợp tự nhiên.
Hạn chế: Một số protein phức tạp có thể gặp khó khăn trong quá trình sản xuất do sự gấp nếp không đúng hoặc yêu cầu môi trường tế bào đặc biệt. Chi phí sản xuất và tiêu chuẩn kiểm định chất lượng cũng là những thách thức cần vượt qua.
Kết luận
Protein tái tổ hợp không chỉ đóng vai trò quan trọng trong các ứng dụng công nghiệp và y tế mà còn là công cụ mạnh mẽ trong nghiên cứu sinh học. Với sự phát triển không ngừng của công nghệ, việc sản xuất và sử dụng protein tái tổ hợp sẽ còn tiếp tục mở rộng và mang lại nhiều lợi ích trong tương lai.
Các phác đồ liều lượng khác nhau của vắc xin protein gai SARS-CoV-2 tái tổ hợp (NVX-CoV2373) ở người lớn trẻ và già: Thử nghiệm đối chứng ngẫu nhiên giai đoạn 2 Dịch bởi AI PLoS Medicine - Tập 18 Số 10 - Trang e1003769
Nền tảng
NVX-CoV2373 là vắc xin hạt nano tái tổ hợp virus corona chủng nặng (rSARS-CoV-2) bao gồm glycoprotein gai SARS-CoV-2 toàn chiều dài có cấu trúc ba trùng kết hợp với tá chất Matrix-M1.
Phương pháp và kết quả
Thành phần giai đoạn 2 của thử nghiệm ngẫu nhiên, đối chứng giả dược, giai đoạn 1 đến 2 của chúng tôi được thiết kế để xác định phác đồ liều lượng nào của NVX-CoV2373 sẽ được tiếp tục trong các nghiên cứu giai đoạn muộn hơn và dựa trên dữ liệu về sức đề kháng miễn dịch và an toàn đến Ngày 35 (14 ngày sau khi tiêm liều thứ hai). Thử nghiệm được tiến hành tại 9 địa điểm ở Úc và 8 địa điểm ở Hoa Kỳ. Người tham gia trong 2 nhóm tuổi (từ 18 đến 59 và 60 đến 84 tuổi) được phân ngẫu nhiên để nhận 1 hoặc 2 liều tiêm bắp 5-μg hoặc 25-μg NVX-CoV2373 hoặc giả dược, cách nhau 21 ngày. Tiêu chí chính là phản ứng kháng thể immunoglobulin G (IgG) chống lại protein gai, sụt cân nhiệt độ trong 7 ngày theo dõi, và các phản ứng không mong muốn không theo dõi trước. Tiêu chí phụ quan trọng là phản ứng kháng thể trung hòa virus dạng hoang dại. Sau khi đăng ký, 1.288 người tham gia được phân ngẫu nhiên vào 1 trong 4 nhóm vắc xin hoặc giả dược, với 1.283 người tham gia nhận ít nhất 1 liệu pháp nghiên cứu. Trong số này, 45% là người tham gia già tuổi từ 60 đến 84 tuổi. Phản ứng miễn dịch chủ yếu là nhẹ đến vừa về cường độ và kéo dài ngắn (trung bình <3 ngày) sau khi tiêm vắc xin NVX-CoV2373 lần đầu tiên và lần thứ hai, với tần suất và cường độ cao hơn sau khi tiêm lần thứ hai và với liều cao hơn. Phản ứng miễn dịch xảy ra ít thường xuyên hơn và cường độ thấp hơn ở người tham gia già tuổi. Cả hai phác đồ liều 5-μg và 25-μg của NVX-CoV2373 đều kích thích phản ứng miễn dịch mạnh mẽ ở người trẻ và người già tuổi. Đối với phác đồ liều 5 μg, mức trung bình hình học (GMTs) đối với IgG chống protein gai là 65,019 (khoảng tin cậy (CI) 95% từ 55,485 đến 76,192) và 28,137 (CI 95% từ 21,617 đến 36,623) EU/mL và đối với kháng thể trung hòa virus dạng hoang dại (với nồng độ ức chế 50%-MN50%) là 2,201 (CI 95% từ 1,343 đến 3,608) và 981 (CI 95% từ 560 đến 1,717) mức độ cho người trẻ và người già tương ứng, với tỷ lệ chuyển đổi huyết thanh là 100% ở cả hai nhóm tuổi. Phản ứng kháng thể trung hòa vượt qua những gì được thấy ở một bảng huyết thanh phục hồi cho cả hai nhóm tuổi. Giới hạn nghiên cứu bao gồm thời gian theo dõi an toàn tương đối ngắn đến hiện tại và thiếu dữ liệu duy trì miễn dịch ngoài các đánh giá thời điểm chính trong phác đồ tiêm chủng chính, nhưng các dữ liệu này sẽ tích luỹ theo thời gian.
Kết luận
Nghiên cứu đã xác nhận các phát hiện từ giai đoạn 1 rằng phác đồ tiêm 2 liều 5-μg của NVX-CoV2373 có sức miễn dịch mạnh mẽ và được dung nạp tốt ở người trưởng thành trẻ tuổi. Ngoài ra, ở người trưởng thành già tuổi, phác đồ 2 liều 5 μg cũng được dung nạp tốt và cho thấy đủ khả năng miễn dịch để hỗ trợ việc sử dụng nó trong các nghiên cứu hiệu quả giai đoạn muộn.
Đăng ký thử nghiệm
ClinicalTrials.gov NCT04368988.
Một chiến lược cung cấp thức ăn được đề xuất cho việc sản xuất quá mức các protein tái tổ hợp trong Escherichia coli Dịch bởi AI Biotechnology and Applied Biochemistry - Tập 49 Số 2 - Trang 141-147 - 2008
Các chiến lược cho ăn khác nhau trong việc sản xuất interferon‐γ của người bằng cách sử dụng hệ thống biểu hiện kích thích bằng isopropyl β‐d‐thiogalactoside trong Escherichia coli BL21(DE3) (plasmid pET3a‐ifnγ) đã được nghiên cứu. Bốn chế độ cung cấp thức ăn theo đợt đã được thiết kế để so sánh ảnh hưởng của μ (tốc độ tăng trưởng riêng) đến sản xuất protein tái tổ hợp, tiêu thụ chất nền, hình thành sản phẩm phụ và độ ổn định của plasmid trong các môi trường nuôi cấy mật độ tế bào cao của E. coli. Kết quả cho thấy Yp/s, sản lượng sản phẩm/chất nền của interferon‐γ bị ảnh hưởng đáng kể bởi μ trong suốt quá trình, nhưng sản lượng sản phẩm/sinh khối (Yp/x) bị ảnh hưởng bởi μ ở giai đoạn trước khi kích thích. Bằng cách áp dụng một chiến lược cung cấp thức ăn hiệu quả, trong đó μ được duy trì ở mức tối đa có thể đạt được, protein tái tổ hợp đã tích lũy tới mức 60% tổng lượng protein tế bào và năng suất của nó đã được tăng lên đáng kể. Trong trường hợp này, tổng năng suất của sinh khối và protein tái tổ hợp lần lượt là 6.36 và 2.1, so với 1.91 và 0.16 g·h−1·lít−1 trong quá trình cho ăn theo hàm mũ, trong đó μ được giữ không đổi trong toàn bộ quá trình.
XÂY DƯNG MỘT PLASMID MỚI ĐỂ GIA TĂNG HIỆU QUẢ TINH SẠCH CHO CÁC PROTEIN TÁI TỔ HỢP BIỂU HIỆN TRONG TẾ BÀO ESCHERICHIA COLINgày nay, nhu cầu trong việc cung cấp các protein tái tổ hợp đã tăng lên trong một số lĩnh vực như công nghệ thực phẩm, dược phẩm y tế, chẩn đoán lâm sàng hoặc xử lý môi trường. Các protein tái tổ hợp đã trở thành những sản phẩm được thương mại hoá và đã được sản xuất với sự gia tăng với một số lượng sản phẩm mỗi năm. Bên cạnh đó, giả định rằng sự kéo dài đuôi his-tag của plasmid pET11a có thể là tạo thuận lợi cho việc loại bỏ đuôi và tinh sạch protein Trong nghiên cứu này, chín nucleotide mã hoá cho ba acid amin alanine được thêm vào vị trí theo sau đuôi hexa-histidine (his-tag) trên cấu trúc plasmid pET11a. Kết quả SDS-PAGE của mỗi protein tái tổ hợp chứa đuôi kéo dài này sau quá trình tinh sạch hầu như chỉ xuất hiện một dải trên gel. Kết quả được quan sát như nhau trên 3 protein tái tổ hợp đã xác định hiệu quả tinh sạch là trên 98%. Do đó, cấu trúc plasmid mới này có thể trở thành một plasmid hiệu quả cho mục tiêu thu nhận các protein tái tổ hợp được độ tinh sạch cao.
#Escherichia coli (E. coli) #histidine-tag #pET11a plasmid #purity effectiveness
TỐI ƯU ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY BIỂU HIỆN PROTEIN KHÁNG NGUYÊN P102 TÁI TỔ HỢP CỦA MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE TRONG E. COLI BL21 (DE3)Mục tiêu của nghiên cứu này là tối ưu điều kiện nuôi cấy bao gồm: nhiệt độ cảm ứng, môi trường nuôi cấy, nồng độ Isopropulβ-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG), thời điểm cảm ứng và thời gian nuôi cấy sau cảm ứng IPTG để biểu hiện tốt hơn protein kháng nguyên P102 tái tổ hợp của Mycoplasma hyopneumoniae (Mh), tác nhân chính gây bệnh suyễn lợn trong tế bào E. coli BL21 (DE3). Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng protein kháng nguyên P102 tái tổ hợp của Mh biểu hiện mạnh nhất ở nhiệt độ cảm ứng 30°C, trên môi trường YJ, với nồng độ 0,6 mM IPTG, mật độ quang (OD600) đạt 0,8 và thời gian nuôi cấy sau cảm ứng là 6 giờ.
#Mycoplasma hyopneumoniae #P102 #Biểu hiện protein #Protein tái tổ hợp
BIỂU HIỆN VÀ TINH SẠCH NHÂN TỐ PHIÊN MÃ NF- κB P65 CỦA NGƯỜI SỬ DỤNG TẾ BÀO VẬT CHỦ E. coli ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG SÀNG LỌC CHẤT ỨC CHẾ UNG THƯĐặt vấn đề: Nhân tố NF-κB p65 tham gia điều hòa biểu hiện hàng loạt gen miễn dịch của tế bào của người. Sự biểu hiện quá mức của NF- κB p65 có liên quan đến nhiều bệnh ung thư. Việc tìm các chất ức chế đặc hiệu NF-κB p65 là hướng đi có nhiều hứa hẹn trong điều trị các loại ung thư liên quan đến con đường tín hiệu NF-κB. Để sàng lọc in vitro các chất ức chế đặc hiệu NF-κB p65 thì việc biểu hiện lượng lớn nhân tố phiên mã này là hết sức cần thiết. Mục tiêu: tối ưu domain liên kết DNA của gen mã hóa NF-κB p65 của người, nhân dòng và biểu hiện trong E. coli định hướng ứng dụng sàng lọc chất ức chế ung thư. Phương pháp: đoạn gen mã hóa domain liên kết với ADN đích của nhân tố phiên mã NF-κB p65 của người được tối ưu mã bộ ba, nhân dòng và biểu hiện trong vi khuẩn E. coli BL21(DE3) sau đó tinh sạch bằng sắc ký ái lực sử dụng hạt niken. Kết quả: gen mã hóa domain liên kết ADN của nhân tố phiên mã NF-κB p65 ở người được tối ưu mã bộ ba thành công. Kết quả biểu hiện ở E. coli cho thấy NF-κB p65 được biểu hiện thành công ở nhiệt độ 20oC và 37oC với nồng độ chất cảm ứng IPTG là 100 µM. Mức độ biểu hiện cao với 50 mg protein tái tổ hợp thu được từ một lít dung dịch LB nuôi cấy. NF-κB p65 tái tổ hợp được tinh sạch với độ tinh sạch cao sử dụng phương pháp sắc ký ái lực với cột niken. Có thể sản xuất lượng lớn NF-kB p65 tái tổ hợp để sử dụng cho sàng lọc và thử nghiệm các chất ức chế ung thư nhằm mục đích điều trị các bệnh ung thư liên quan đến rối loạn biểu hiện NF-κB p65. Kết luận: Gen mã hóa nhân tố phiên mã NF-κB p65 được nhân dòng và biểu hiện thành công trong vi khuẩn E. coli BL21(DE3). Mức độ biểu hiện NF-κB p65 tái tổ hợp khá cao có thể ứng dụng trong nghiên cứu và sàng lọc các loại chất ức chế các bệnh ung thư liên quan.
#nhân tố phiên mã #NF-κB #p65 #biểu hiện gen #protein tái tổ hợp #sắc ký ái lực với niken
ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH CHỈNH SỬA GEN BCL11A TRÊN THỰC NGHIỆM CỦA PROTEIN CAS9 TÁI TỔ HỢP, ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG ĐIỀU TRỊ BỆNH HỒNG CẦU LIỀMMục tiêu: Thiết kế phức hợp rCas9/sgRNA để chỉnh sửa gen BCL11A tách dòng vào plasmid pJET1.2 trong điều kiện in vitro nhằm đánh giá hoạt tính protein Cas9 tái tổ hợp và định hướng ứng dụng điều trị bệnh hồng cầu liềm. Đối tượng và phương pháp: Khuếch đại vùng Enhancer của gen BCL11A bằng phản ứng PCR, phân tích so sánh trình tự với DNA của người Việt Nam. Thiết kế chuỗi đơn RNA dẫn đường (sgRNA) và tạo phức hợp rCas9/sgRNA. Thử nghiệm hoạt tính phức hợp trêngen BCL11A đã được tách dòng vào plasmid pJET1.2 trong điều kiện in vitro. Kết quả: Phức hợp rCas9/sgRNA tổng hợp được đã cắt vùng enhancer của gen BCL11Atrên in vitro thành 2 sản phẩm có kích thước khoảng 240bp. Giải trình tự gen sảm phẩm PCR cho thấy phức hợp rCas9/sgRNA đã cắt vùng gen enhancer GATAA của BCL11A tại vị trí cách vùng PAM 3 cặp nucleotide theo đúng tính toán lý thuyết. Kết luận: Protein Cas9 tái tổ hợp có hoạt tính tương tự protein Cas9 tự nhiên và phức hợp rCas9/sgRNAcần được tiếp tục nghiên cứu đểứng dụng trong chỉnh sửa gen BCL11A điều trị bệnh hồng cầu liềm trên lâm sàng.
#Hệ thống CRISPR/Cas9 #bệnh hồng cầu liềm #chỉnh sửa gen
BIỂU HIỆN VÀ TINH SẠCH CHITINASE TỪ BACILLUS THURINGIENSIS SEROVAR KURSTAKI TRONG VI KHUẨN ESCHERICHIA COLITrong nghiên cứu trước, chúng tôi đã phân lập được chủng vi khuẩn B. thuringiensis serovar kurstaki (Btk) MSS1.1 có khả năng thủy phân chitin cao. Chủng Btk MSS1.1 đã được dùng để tạo chế phẩm kháng nấm gây bệnh thực vật và diệt côn trùng gây hại, tuy nhiên hiệu suất còn thấp và khó nâng cao hiệu quả sinh tổng hợp của chitinase - enzyme chìa khóa quyết định hiệu quả phòng bệnh của chế phẩm. Để khắc phục hạn chế này các nhà nghiên cứu áp dụng công nghệ protein tái tổ hợp để sản xuất chitinase qui mô công nghiệp. Hướng đi này giúp nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp chitinase đồng thời dễ dàng tinh sạch và thu hồi enzyme hơn so với việc sử dụng chủng tự nhiên. Nhằm mục đích thu được lượng lớn enzyme có hoạt tính cao, chúng tôi tiến hành biểu hiện và thu nhận chitinase tái tổ hợp (rChiA) từ chủng Btk trong E. coli. Gene mã hóa chitinase của chủng Btk được thiết kế vào vector biểu hiện pET28b(+) tại vị trí EcoRI và XhoI. Protein tái tổ hợp được biểu hiện ở dạng tan và vẫn duy trì hoạt tính sinh học. Hoạt tính của chitinase tái tổ hợp tăng 1,26 lần so với chitinase tự nhiên. rChiA được tinh sạch thành công bằng sắc k. ái lực sử dụng cột Probond Nikel Resin. Kết quả thử nghiệm cho thấy, chitinase tái tổ hợp có khả năng kháng 2 loại nấm gây bệnh thực vật là Fusarium oxysporum và Rhizoctinia solani nhưng không gây ảnh hưởng đến Mucor sp. Ngoài ra, chitinase tái tổ hợp còn làm tăng hoạt tính diệt sâu tơ (Plutella xylostella) và sâu khoang (Spodoptera litura) của protein tinh thể thu nhận từ chủng B. thuringiensis tự nhiên. Khi sử dụng kết hợp rChiA với protein tinh thể từ chủng SP10.6 đã rút ngắn thời gian gây chết từ 72 giờ xuống còn 48 giờ (gây chết 100% đối với sâu tơ và 84,3% đối với sâu khoang), đồng thời giá trị LC50 giảm 8,04 % và 6,80% lần lượt đối với sâu tơ và sâu khoang.
#kháng nấm #nồng độ gây chết 50% #protein tinh thể #protein tái tổ hợp #tinh sạch protein #vector biểu hiện.
